追問｜中國科學家開發(fā)的工具實現(xiàn)對數百萬個細胞“入戶調查”

· 長期看，“原創(chuàng)工程化平臺+開放協(xié)作”將是中國走向重大通用技術誕生的必由之路。

每個細胞就像一座微型城市，有自己的“城市政策”（基因）、“工廠”（蛋白合成）和“地理規(guī)劃”（組織結構）。要想真正理解一塊組織、一種疾病，甚至一個生命的成長過程，我們不僅要知道這些城市里發(fā)生了什么，還要知道它們是如何排列、交流、協(xié)作的。

李晶昀 AI圖

在對生命進行“城市調查”的過程中，科學家們也經歷了從“航拍”到“入戶普查”的跨越，能夠通過基因測序等技術獲得更多、更細致的信息。然而，主流的單細胞測序技術還存在著通量、成本、細胞大小限制和捕獲偏好性等挑戰(zhàn)。

8月22日，《科學》雜志發(fā)表了由華大生命科學研究院牽頭建設的基因組多維解析技術全國重點實驗室等機構合作完成的最新研究，介紹了一種全新的單細胞多組學技術 Stereo-cell，它可在一次實驗中無偏、高通量地捕獲從百到百萬級的細胞，既能分析轉錄組（RNA），又能結合蛋白、細胞形態(tài)和位置等多模態(tài)信息，甚至適用于超大細胞和特殊形態(tài)的微結構。這一平臺的核心是中國自主研發(fā)的“DNA納米球（DNB）陣列芯片”，有望為生命科學研究、疾病診斷和藥物開發(fā)提供新的基礎工具。

科學家究竟是如何同時對數百萬個細胞進行“入戶調查”的？中國自主研發(fā)的“DNB”納米球是如何工作的？如何看待中國基礎科研工具的發(fā)展？為了回答這些問題，澎湃科技采訪了論文共同第一作者、華大生命科學研究院副研究員劉暢。

【對話】

澎湃科技：能否為我們形象解釋一下什么是單細胞測序技術？主流的技術路徑都有哪些？它們主要解決了哪些問題，又存在哪些限制？

劉暢（論文共同第一作者、華大生命科學研究院副研究員）： 我們可以做一個簡單的類比來解釋：一個組織或器官就像一籃子混合了多種水果，比如蘋果、香蕉和橙子。過去的常規(guī)測序技術（bulk-seq）好比是把這一籃子水果全部丟進榨汁機，打成一杯混合果汁。我們能品嘗到這杯果汁的整體風味，檢測出它的平均甜度，但無法知道其中具體有哪幾種水果，更不知道蘋果和橙子各自的味道。

而單細胞測序技術，則是讓我們有能力去單獨品嘗每一種水果的口味和甜度，并且能清晰地知道這籃水果里包含了哪幾類，每一類的數量是多少。對應到生物學上，常規(guī)測序只能檢測一個組織樣本中所有基因的平均表達水平，而單細胞測序則能檢測到每一個細胞的基因表達情況，從而精確解讀組織內不同細胞的異質性。正因如此，這項技術對理解發(fā)育、疾病和免疫等過程至關重要，也是“人類細胞圖譜計劃”的核心支撐技術。

得到分散的單細胞后，關鍵一步就是為每個細胞內的遺傳物質（如RNA）做好標記和準備，使其能被測序儀讀取，這個過程我們稱之為“文庫構建”。圍繞這一步，科學家們開發(fā)了多種方法，主要分為四個技術方向：

第一種是基于單管的方法，也是最早的技術。顧名思義，就是把單個細胞小心翼翼地放進獨立的離心管里進行操作。它能獲得非常完整的基因信息，但通量極低，操作繁瑣，成本高昂。

第二種是基于多孔板的技術，通過自動化設備將細胞分選到微小的孔板中。這比單管法有進步，但本質上還是“一個蘿卜一個坑”，實驗通量和工作量的改善有限。

第三種是革命性的基于微流控的技術，這也是目前最主流的方法之一。它利用精密的微管道，將單個細胞和帶有獨特分子標簽的微珠包裹在一個個微小的油滴里。這樣，同一個細胞的遺傳物質就會被標記上相同的“身份證”，后續(xù)我們就可以把所有細胞的物質混合處理，大大簡化了流程，將通量提升到萬級細胞。但這類方法有時會“挑食”，對特別大或形態(tài)不規(guī)則的細胞不太友好。

第四種是基于聯(lián)合標簽的技術，為了追求更高的通量。它通過多輪的混合、標記、再分組，像編密碼一樣為每個細胞核生成一個極其復雜的組合標簽，理論上可以達到百萬甚至更高的通量。但它的操作流程非常繁瑣，且容易在過程中丟失細胞，限制了其廣泛應用。

澎湃科技：從華大之前研發(fā)的Stereo-seq到現(xiàn)在的Stereo-cell，其核心部件DNB陣列芯片讓人感覺非常神奇。能否給我們講講這個想法是怎么形成的？這些組件具體是如何工作的？

劉暢：這個想法的核心靈感來源于華大自主研發(fā)的高通量測序平臺，其關鍵就是“DNA納米球（DNB）測序”技術。在測序時，我們會將待測的DNA片段通過一種叫做“滾環(huán)擴增”的技術，在芯片表面復制成數億個致密的、大小僅為納米級的DNA小球（DNB），然后再原位讀取它們的序列。

那進一步地技術研發(fā)過程中，我們就想能不能用這些神奇的DNA納米球做一些其他技術方向的拓展。比如設計這個小球能夠帶上一些獨特的信息，能夠幫助定位其在芯片上的位置。簡單類比一下，假如你想給你家里的每一本書（細胞）都貼上一個獨一無二的地址標簽，但普通的紙質標簽太小、信息量太少。DNA是一種天然的能夠攜帶大量信息的材料，于是我們用DNA設計了一個包含書架號、層號、位置號的數字編碼，然后用一臺特殊的“復印機”，把這個編碼復制粘貼了上千次，形成一條極長的DNA細線。跟細胞核里的DNA類似，這條線會自動蜷縮成一個納米小球，這個小球就成了你這本書的專屬“地址球”。對它們進行測序就可以獲得位置信息。

既然可以在芯片上原位讀取序列，那是否也能在芯片上原位“捕獲”序列呢？于是，Stereo-seq（空間組學技術）誕生了。我們改造了芯片，讓平整的硅基芯片上陣列化地排布著DNB，每個DNB上都附著著大量帶有“地址編碼（空間坐標條碼CID）”和“分子條碼（UMI）”的探針。當我們把組織切片鋪在芯片上時，組織細胞釋放的RNA就會被這些探針原位捕獲，因為每個探針都自帶地址，我們就實現(xiàn)了在保留空間位置信息的前提下進行測序。

Stereo-cell則是這個思路的自然延伸和創(chuàng)新。既然芯片能捕獲組織切片的RNA，那能不能直接用來捕獲懸浮的單個細胞呢？答案是肯定的。我們無需復雜的微流控設備或油滴，只需將單細胞懸液滴在平整的芯片上，細胞會依靠靜電吸附均勻地“坐”在芯片表面。隨后，細胞內的轉錄本被原位釋放，并被下方的DNB探針捕獲、建庫和測序。

因為細胞是鋪在平面上的，我們可以先用顯微鏡給它們拍一張“集體照”。通過這張照片，結合后續(xù)的測序數據，算法可以精確地定位每個細胞、分割出它的邊界，并把那些靠得太近或者重疊的“雙細胞”剔除掉。我們還可以結合免疫熒光染色，在測序前就看到某些關鍵蛋白在細胞上的分布。最終，我們能在一張芯片上，同步獲得從幾百到上百萬個細胞的轉錄組信息、蛋白表位信息和細胞形態(tài)位置信息，實現(xiàn)真正意義上的高通量、多模態(tài)單細胞分析。

澎湃科技：Stereo-cell有哪些優(yōu)勢？

劉暢：它的優(yōu)勢非常突出，首先是超寬通量范圍，一次實驗可以處理從幾百個珍稀細胞到上百萬個細胞的樣本，靈活度極高。

其次是無偏好性捕獲。因為它沒有物理篩選的管道，所以對細胞大小和形態(tài)不“挑食”。我們在論文中展示了它能成功捕獲含有多個細胞核的巨大骨骼肌纖維，以及直徑上百微米的卵母細胞，這是傳統(tǒng)方法難以做到的。

另外，它天然兼容成像技術，可以輕松整合免疫熒光（看蛋白）和抗體條碼（CITE-seq），在一次實驗中獲得基因、蛋白、形態(tài)三個維度的數據。

最后，我們可以直接在DNB芯片上培養(yǎng)細胞，進行藥物處理或誘導分化，實現(xiàn)對細胞動態(tài)變化過程的“快照”式測序。

澎湃科技：它能取代液滴等傳統(tǒng)單細胞測序的方法嗎？

劉暢：我們認為Stereo-cell與液滴等傳統(tǒng)方法是互補關系，而非完全取代。液滴法在常規(guī)的高通量轉錄組分析上已經非常成熟和普及。而Stereo-cell則在多模態(tài)分析、空間定位、超大細胞/微結構研究、液基樣本（如血液、體液）檢測以及動態(tài)過程研究上，展現(xiàn)了獨特的、不可替代的優(yōu)勢。科學家可以根據自己的研究問題，選擇最合適的工具。

澎湃科技：任何技術都不是完美的，論文中也提到了RNA側向擴散等潛在問題。這些問題對數據準確性的影響有多大？在您看來該技術還有哪些提升空間？

劉暢：我們系統(tǒng)地評估了RNA側向擴散的問題。簡單來說，就是細胞內的RNA分子在被芯片探針捕獲時，可能會向周圍“漂移”一小段距離。我們的數據顯示，這個距離是存在的，大約在5微米。

但這是否會影響數據的準確性呢？我們通過人-鼠細胞混合實驗發(fā)現(xiàn)，在控制得當的細胞鋪板密度下，細胞間的平均距離遠大于這個擴散距離。最終，一個細胞錯誤地捕獲到旁邊細胞（來自另一物種）的RNA比例，峰值僅為2.7%左右。再加上我們利用成像技術可以識別并剔除那些靠得太近的細胞，所以這種擴散對單個細胞內基因準確定量的影響，被控制在了一個非常低且可接受的水平。

至于提升空間，我們認為主要有幾方面，首先是流程優(yōu)化與成本。目前大尺寸芯片的制造和數據分析流程還比較復雜，未來需要持續(xù)優(yōu)化，推進自動化，讓它變得更成本友好、更易于普及。

另外，極低細胞輸入會影響性能。在處理非常稀少的細胞樣本時（比如一張芯片只放200個細胞），文庫的復雜度會下降，影響數據質量。未來可以通過優(yōu)化測序深度、改進生化反應體系等策略來改善。

目前我們主要實現(xiàn)了轉錄組和部分蛋白的檢測，未來希望能夠整合更多的組學信息，并在更大尺寸的芯片上實現(xiàn)一體化、自動化的成像方案。

澎湃科技：假如現(xiàn)在資源和樣本都不是問題，您最想用Stereo-cell去研究什么？期望解開什么謎題？

劉暢：三類方向最令我們興奮。首先是生命發(fā)育與生殖，可以研究人/模式生物卵母細胞—早期胚胎的時空調控網絡；

其次是腫瘤與免疫，如循環(huán)腫瘤細胞/免疫細胞在治療前后的稀有亞群動態(tài)；

最后是組織修復與纖維化，如肌纖維/微血管/間充質等微結構的多尺度重建與藥物擾動圖譜。

這三者都需要高通量+多模態(tài)+空間/時間分辨的綜合能力，Stereo-cell天然契合。

澎湃科技：很多底層的科學研究工具仍然被國外壟斷。您如何看待目前國內對于研究工具的創(chuàng)新趨勢？有哪些長處和短板？中國會誕生像基因編輯、冷凍電鏡等重要發(fā)明嗎？

劉暢：趨勢上，從跟跑到并跑乃至部分領跑已可見端倪，包括高密度DNB芯片/設備鏈條、空間-單細胞一體化平臺等均已取得實質性進展。

短板在于生態(tài)與標準、從原型到量產、從實驗室到產業(yè)級穩(wěn)定性、從點技術到體系化配套（試劑、軟件、質控、培訓），仍需時間與耐心。長期看，“原創(chuàng)工程化平臺+開放協(xié)作”將是中國走向重大通用技術誕生的必由之路。

澎湃科技：如今，生物學研究越來越依賴于這樣復雜而精密的工程技術。對于那些對生命科學充滿熱情，但可能對編程、工程感到些許畏懼的年輕學生，您有什么建議？

劉暢：我的建議是，首先從問題出發(fā)，而非技術。永遠讓你想解答的那個生物學問題來驅動你選擇和學習工具，而不是為了用一個炫酷的技術而去找問題。

其次，學會“看懂”數據，而非必須“創(chuàng)造”算法。對于大多數生物學家來說，掌握基礎的統(tǒng)計學知識和數據可視化能力，能夠熟練使用標準化的分析流程就足夠了。把更專業(yè)的算法開發(fā)交給專業(yè)的合作伙伴。

 擁抱合作。現(xiàn)代科學，尤其是前沿領域，一定是團隊協(xié)作的成果。主動和工程師、數據科學家交朋友，學會清晰地描述你的問題和需求，把復雜的大問題拆解成可以合作解決的小模塊。

最后，堅持科學研究的基本準則：可復現(xiàn)、可共享。養(yǎng)成良好的實驗記錄、版本管理和數據倫理習慣，這是成為一名優(yōu)秀科學家的基礎。

總而言之，科學從來都是團隊運動。對新技術保持好奇心和學習的耐心，同時專注于自己熱愛的生物學問題，你一定能走得更遠。