追問｜中國(guó)科學(xué)家開發(fā)的工具實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞“入戶調(diào)查”

· 長(zhǎng)期看，“原創(chuàng)工程化平臺(tái)+開放協(xié)作”將是中國(guó)走向重大通用技術(shù)誕生的必由之路。

每個(gè)細(xì)胞就像一座微型城市，有自己的“城市政策”（基因）、“工廠”（蛋白合成）和“地理規(guī)劃”（組織結(jié)構(gòu)）。要想真正理解一塊組織、一種疾病，甚至一個(gè)生命的成長(zhǎng)過程，我們不僅要知道這些城市里發(fā)生了什么，還要知道它們是如何排列、交流、協(xié)作的。

李晶昀 AI圖

在對(duì)生命進(jìn)行“城市調(diào)查”的過程中，科學(xué)家們也經(jīng)歷了從“航拍”到“入戶普查”的跨越，能夠通過基因測(cè)序等技術(shù)獲得更多、更細(xì)致的信息。然而，主流的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還存在著通量、成本、細(xì)胞大小限制和捕獲偏好性等挑戰(zhàn)。

8月22日，《科學(xué)》雜志發(fā)表了由華大生命科學(xué)研究院牽頭建設(shè)的基因組多維解析技術(shù)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等機(jī)構(gòu)合作完成的最新研究，介紹了一種全新的單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù) Stereo-cell，它可在一次實(shí)驗(yàn)中無(wú)偏、高通量地捕獲從百到百萬(wàn)級(jí)的細(xì)胞，既能分析轉(zhuǎn)錄組（RNA），又能結(jié)合蛋白、細(xì)胞形態(tài)和位置等多模態(tài)信息，甚至適用于超大細(xì)胞和特殊形態(tài)的微結(jié)構(gòu)。這一平臺(tái)的核心是中國(guó)自主研發(fā)的“DNA納米球（DNB）陣列芯片”，有望為生命科學(xué)研究、疾病診斷和藥物開發(fā)提供新的基礎(chǔ)工具。

科學(xué)家究竟是如何同時(shí)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行“入戶調(diào)查”的？中國(guó)自主研發(fā)的“DNB”納米球是如何工作的？如何看待中國(guó)基礎(chǔ)科研工具的發(fā)展？為了回答這些問題，澎湃科技采訪了論文共同第一作者、華大生命科學(xué)研究院副研究員劉暢。

【對(duì)話】

澎湃科技：能否為我們形象解釋一下什么是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)？主流的技術(shù)路徑都有哪些？它們主要解決了哪些問題，又存在哪些限制？

劉暢（論文共同第一作者、華大生命科學(xué)研究院副研究員）： 我們可以做一個(gè)簡(jiǎn)單的類比來(lái)解釋：一個(gè)組織或器官就像一籃子混合了多種水果，比如蘋果、香蕉和橙子。過去的常規(guī)測(cè)序技術(shù)（bulk-seq）好比是把這一籃子水果全部丟進(jìn)榨汁機(jī)，打成一杯混合果汁。我們能品嘗到這杯果汁的整體風(fēng)味，檢測(cè)出它的平均甜度，但無(wú)法知道其中具體有哪幾種水果，更不知道蘋果和橙子各自的味道。

而單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，則是讓我們有能力去單獨(dú)品嘗每一種水果的口味和甜度，并且能清晰地知道這籃水果里包含了哪幾類，每一類的數(shù)量是多少。對(duì)應(yīng)到生物學(xué)上，常規(guī)測(cè)序只能檢測(cè)一個(gè)組織樣本中所有基因的平均表達(dá)水平，而單細(xì)胞測(cè)序則能檢測(cè)到每一個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)情況，從而精確解讀組織內(nèi)不同細(xì)胞的異質(zhì)性。正因如此，這項(xiàng)技術(shù)對(duì)理解發(fā)育、疾病和免疫等過程至關(guān)重要，也是“人類細(xì)胞圖譜計(jì)劃”的核心支撐技術(shù)。

得到分散的單細(xì)胞后，關(guān)鍵一步就是為每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)（如RNA）做好標(biāo)記和準(zhǔn)備，使其能被測(cè)序儀讀取，這個(gè)過程我們稱之為“文庫(kù)構(gòu)建”。圍繞這一步，科學(xué)家們開發(fā)了多種方法，主要分為四個(gè)技術(shù)方向：

第一種是基于單管的方法，也是最早的技術(shù)。顧名思義，就是把單個(gè)細(xì)胞小心翼翼地放進(jìn)獨(dú)立的離心管里進(jìn)行操作。它能獲得非常完整的基因信息，但通量極低，操作繁瑣，成本高昂。

第二種是基于多孔板的技術(shù)，通過自動(dòng)化設(shè)備將細(xì)胞分選到微小的孔板中。這比單管法有進(jìn)步，但本質(zhì)上還是“一個(gè)蘿卜一個(gè)坑”，實(shí)驗(yàn)通量和工作量的改善有限。

第三種是革命性的基于微流控的技術(shù)，這也是目前最主流的方法之一。它利用精密的微管道，將單個(gè)細(xì)胞和帶有獨(dú)特分子標(biāo)簽的微珠包裹在一個(gè)個(gè)微小的油滴里。這樣，同一個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)就會(huì)被標(biāo)記上相同的“身份證”，后續(xù)我們就可以把所有細(xì)胞的物質(zhì)混合處理，大大簡(jiǎn)化了流程，將通量提升到萬(wàn)級(jí)細(xì)胞。但這類方法有時(shí)會(huì)“挑食”，對(duì)特別大或形態(tài)不規(guī)則的細(xì)胞不太友好。

第四種是基于聯(lián)合標(biāo)簽的技術(shù)，為了追求更高的通量。它通過多輪的混合、標(biāo)記、再分組，像編密碼一樣為每個(gè)細(xì)胞核生成一個(gè)極其復(fù)雜的組合標(biāo)簽，理論上可以達(dá)到百萬(wàn)甚至更高的通量。但它的操作流程非常繁瑣，且容易在過程中丟失細(xì)胞，限制了其廣泛應(yīng)用。

澎湃科技：從華大之前研發(fā)的Stereo-seq到現(xiàn)在的Stereo-cell，其核心部件DNB陣列芯片讓人感覺非常神奇。能否給我們講講這個(gè)想法是怎么形成的？這些組件具體是如何工作的？

劉暢：這個(gè)想法的核心靈感來(lái)源于華大自主研發(fā)的高通量測(cè)序平臺(tái)，其關(guān)鍵就是“DNA納米球（DNB）測(cè)序”技術(shù)。在測(cè)序時(shí)，我們會(huì)將待測(cè)的DNA片段通過一種叫做“滾環(huán)擴(kuò)增”的技術(shù)，在芯片表面復(fù)制成數(shù)億個(gè)致密的、大小僅為納米級(jí)的DNA小球（DNB），然后再原位讀取它們的序列。

那進(jìn)一步地技術(shù)研發(fā)過程中，我們就想能不能用這些神奇的DNA納米球做一些其他技術(shù)方向的拓展。比如設(shè)計(jì)這個(gè)小球能夠帶上一些獨(dú)特的信息，能夠幫助定位其在芯片上的位置。簡(jiǎn)單類比一下，假如你想給你家里的每一本書（細(xì)胞）都貼上一個(gè)獨(dú)一無(wú)二的地址標(biāo)簽，但普通的紙質(zhì)標(biāo)簽太小、信息量太少。DNA是一種天然的能夠攜帶大量信息的材料，于是我們用DNA設(shè)計(jì)了一個(gè)包含書架號(hào)、層號(hào)、位置號(hào)的數(shù)字編碼，然后用一臺(tái)特殊的“復(fù)印機(jī)”，把這個(gè)編碼復(fù)制粘貼了上千次，形成一條極長(zhǎng)的DNA細(xì)線。跟細(xì)胞核里的DNA類似，這條線會(huì)自動(dòng)蜷縮成一個(gè)納米小球，這個(gè)小球就成了你這本書的專屬“地址球”。對(duì)它們進(jìn)行測(cè)序就可以獲得位置信息。

既然可以在芯片上原位讀取序列，那是否也能在芯片上原位“捕獲”序列呢？于是，Stereo-seq（空間組學(xué)技術(shù)）誕生了。我們改造了芯片，讓平整的硅基芯片上陣列化地排布著DNB，每個(gè)DNB上都附著著大量帶有“地址編碼（空間坐標(biāo)條碼CID）”和“分子條碼（UMI）”的探針。當(dāng)我們把組織切片鋪在芯片上時(shí)，組織細(xì)胞釋放的RNA就會(huì)被這些探針原位捕獲，因?yàn)槊總€(gè)探針都自帶地址，我們就實(shí)現(xiàn)了在保留空間位置信息的前提下進(jìn)行測(cè)序。

Stereo-cell則是這個(gè)思路的自然延伸和創(chuàng)新。既然芯片能捕獲組織切片的RNA，那能不能直接用來(lái)捕獲懸浮的單個(gè)細(xì)胞呢？答案是肯定的。我們無(wú)需復(fù)雜的微流控設(shè)備或油滴，只需將單細(xì)胞懸液滴在平整的芯片上，細(xì)胞會(huì)依靠靜電吸附均勻地“坐”在芯片表面。隨后，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本被原位釋放，并被下方的DNB探針捕獲、建庫(kù)和測(cè)序。

因?yàn)榧?xì)胞是鋪在平面上的，我們可以先用顯微鏡給它們拍一張“集體照”。通過這張照片，結(jié)合后續(xù)的測(cè)序數(shù)據(jù)，算法可以精確地定位每個(gè)細(xì)胞、分割出它的邊界，并把那些靠得太近或者重疊的“雙細(xì)胞”剔除掉。我們還可以結(jié)合免疫熒光染色，在測(cè)序前就看到某些關(guān)鍵蛋白在細(xì)胞上的分布。最終，我們能在一張芯片上，同步獲得從幾百到上百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息、蛋白表位信息和細(xì)胞形態(tài)位置信息，實(shí)現(xiàn)真正意義上的高通量、多模態(tài)單細(xì)胞分析。

澎湃科技：Stereo-cell有哪些優(yōu)勢(shì)？

劉暢：它的優(yōu)勢(shì)非常突出，首先是超寬通量范圍，一次實(shí)驗(yàn)可以處理從幾百個(gè)珍稀細(xì)胞到上百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的樣本，靈活度極高。

其次是無(wú)偏好性捕獲。因?yàn)樗鼪]有物理篩選的管道，所以對(duì)細(xì)胞大小和形態(tài)不“挑食”。我們?cè)谡撐闹姓故玖怂艹晒Σ东@含有多個(gè)細(xì)胞核的巨大骨骼肌纖維，以及直徑上百微米的卵母細(xì)胞，這是傳統(tǒng)方法難以做到的。

另外，它天然兼容成像技術(shù)，可以輕松整合免疫熒光（看蛋白）和抗體條碼（CITE-seq），在一次實(shí)驗(yàn)中獲得基因、蛋白、形態(tài)三個(gè)維度的數(shù)據(jù)。

最后，我們可以直接在DNB芯片上培養(yǎng)細(xì)胞，進(jìn)行藥物處理或誘導(dǎo)分化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化過程的“快照”式測(cè)序。

澎湃科技：它能取代液滴等傳統(tǒng)單細(xì)胞測(cè)序的方法嗎？

劉暢：我們認(rèn)為Stereo-cell與液滴等傳統(tǒng)方法是互補(bǔ)關(guān)系，而非完全取代。液滴法在常規(guī)的高通量轉(zhuǎn)錄組分析上已經(jīng)非常成熟和普及。而Stereo-cell則在多模態(tài)分析、空間定位、超大細(xì)胞/微結(jié)構(gòu)研究、液基樣本（如血液、體液）檢測(cè)以及動(dòng)態(tài)過程研究上，展現(xiàn)了獨(dú)特的、不可替代的優(yōu)勢(shì)。科學(xué)家可以根據(jù)自己的研究問題，選擇最合適的工具。

澎湃科技：任何技術(shù)都不是完美的，論文中也提到了RNA側(cè)向擴(kuò)散等潛在問題。這些問題對(duì)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的影響有多大？在您看來(lái)該技術(shù)還有哪些提升空間？

劉暢：我們系統(tǒng)地評(píng)估了RNA側(cè)向擴(kuò)散的問題。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是細(xì)胞內(nèi)的RNA分子在被芯片探針捕獲時(shí)，可能會(huì)向周圍“漂移”一小段距離。我們的數(shù)據(jù)顯示，這個(gè)距離是存在的，大約在5微米。

但這是否會(huì)影響數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性呢？我們通過人-鼠細(xì)胞混合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在控制得當(dāng)?shù)募?xì)胞鋪板密度下，細(xì)胞間的平均距離遠(yuǎn)大于這個(gè)擴(kuò)散距離。最終，一個(gè)細(xì)胞錯(cuò)誤地捕獲到旁邊細(xì)胞（來(lái)自另一物種）的RNA比例，峰值僅為2.7%左右。再加上我們利用成像技術(shù)可以識(shí)別并剔除那些靠得太近的細(xì)胞，所以這種擴(kuò)散對(duì)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因準(zhǔn)確定量的影響，被控制在了一個(gè)非常低且可接受的水平。

至于提升空間，我們認(rèn)為主要有幾方面，首先是流程優(yōu)化與成本。目前大尺寸芯片的制造和數(shù)據(jù)分析流程還比較復(fù)雜，未來(lái)需要持續(xù)優(yōu)化，推進(jìn)自動(dòng)化，讓它變得更成本友好、更易于普及。

另外，極低細(xì)胞輸入會(huì)影響性能。在處理非常稀少的細(xì)胞樣本時(shí)（比如一張芯片只放200個(gè)細(xì)胞），文庫(kù)的復(fù)雜度會(huì)下降，影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。未來(lái)可以通過優(yōu)化測(cè)序深度、改進(jìn)生化反應(yīng)體系等策略來(lái)改善。

目前我們主要實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄組和部分蛋白的檢測(cè)，未來(lái)希望能夠整合更多的組學(xué)信息，并在更大尺寸的芯片上實(shí)現(xiàn)一體化、自動(dòng)化的成像方案。

澎湃科技：假如現(xiàn)在資源和樣本都不是問題，您最想用Stereo-cell去研究什么？期望解開什么謎題？

劉暢：三類方向最令我們興奮。首先是生命發(fā)育與生殖，可以研究人/模式生物卵母細(xì)胞—早期胚胎的時(shí)空調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；

其次是腫瘤與免疫，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞/免疫細(xì)胞在治療前后的稀有亞群動(dòng)態(tài)；

最后是組織修復(fù)與纖維化，如肌纖維/微血管/間充質(zhì)等微結(jié)構(gòu)的多尺度重建與藥物擾動(dòng)圖譜。

這三者都需要高通量+多模態(tài)+空間/時(shí)間分辨的綜合能力，Stereo-cell天然契合。

澎湃科技：很多底層的科學(xué)研究工具仍然被國(guó)外壟斷。您如何看待目前國(guó)內(nèi)對(duì)于研究工具的創(chuàng)新趨勢(shì)？有哪些長(zhǎng)處和短板？中國(guó)會(huì)誕生像基因編輯、冷凍電鏡等重要發(fā)明嗎？

劉暢：趨勢(shì)上，從跟跑到并跑乃至部分領(lǐng)跑已可見端倪，包括高密度DNB芯片/設(shè)備鏈條、空間-單細(xì)胞一體化平臺(tái)等均已取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

短板在于生態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)、從原型到量產(chǎn)、從實(shí)驗(yàn)室到產(chǎn)業(yè)級(jí)穩(wěn)定性、從點(diǎn)技術(shù)到體系化配套（試劑、軟件、質(zhì)控、培訓(xùn)），仍需時(shí)間與耐心。長(zhǎng)期看，“原創(chuàng)工程化平臺(tái)+開放協(xié)作”將是中國(guó)走向重大通用技術(shù)誕生的必由之路。

澎湃科技：如今，生物學(xué)研究越來(lái)越依賴于這樣復(fù)雜而精密的工程技術(shù)。對(duì)于那些對(duì)生命科學(xué)充滿熱情，但可能對(duì)編程、工程感到些許畏懼的年輕學(xué)生，您有什么建議？

劉暢：我的建議是，首先從問題出發(fā)，而非技術(shù)。永遠(yuǎn)讓你想解答的那個(gè)生物學(xué)問題來(lái)驅(qū)動(dòng)你選擇和學(xué)習(xí)工具，而不是為了用一個(gè)炫酷的技術(shù)而去找問題。

其次，學(xué)會(huì)“看懂”數(shù)據(jù)，而非必須“創(chuàng)造”算法。對(duì)于大多數(shù)生物學(xué)家來(lái)說(shuō)，掌握基礎(chǔ)的統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)和數(shù)據(jù)可視化能力，能夠熟練使用標(biāo)準(zhǔn)化的分析流程就足夠了。把更專業(yè)的算法開發(fā)交給專業(yè)的合作伙伴。

 擁抱合作。現(xiàn)代科學(xué)，尤其是前沿領(lǐng)域，一定是團(tuán)隊(duì)協(xié)作的成果。主動(dòng)和工程師、數(shù)據(jù)科學(xué)家交朋友，學(xué)會(huì)清晰地描述你的問題和需求，把復(fù)雜的大問題拆解成可以合作解決的小模塊。

最后，堅(jiān)持科學(xué)研究的基本準(zhǔn)則：可復(fù)現(xiàn)、可共享。養(yǎng)成良好的實(shí)驗(yàn)記錄、版本管理和數(shù)據(jù)倫理習(xí)慣，這是成為一名優(yōu)秀科學(xué)家的基礎(chǔ)。

總而言之，科學(xué)從來(lái)都是團(tuán)隊(duì)運(yùn)動(dòng)。對(duì)新技術(shù)保持好奇心和學(xué)習(xí)的耐心，同時(shí)專注于自己熱愛的生物學(xué)問題，你一定能走得更遠(yuǎn)。